Методы стерилизации. Подготовка  посуды, инструментов и  материалов к стерилизации

Полное освобождение любого материала от живых микроорганизмов и их покоящихся форм называется  стерилизацией, или обеспложиванием. В основу стерилизации положена способность определенных факторов вызывать гибель микроорганизмов и их спор. Агенты, вызывающие гибель микробных клеток, называются бактерицидными. В качестве стерилизующих  используются прежде всего те из них, для которых не возникает  необходимость последующего их удаления  с обрабатываемого материала. К таким агентам относятся высокая температура, лучевая энергия, некоторые летучие химические соединения. Жидкости можно освободить от микробов фильтрованием.

Стерилизация под действием температур

Наиболее  часто для стерилизации используют высокие температуры, вызывающие гибель клеток микроорганизмов. Действие на микроорганизмы низких температур (–190°C в жидком азоте или при –252°С в жидком кислороде) не вызывает значительных изменений в их клетках. Эффективность бактерицидного действия температурного фактора зависит от степени нагревания, продолжительности воздействия данной температуры, вида микроорганизма, а также от состава среды, в которой он находится. Для уничтожения вегетативных форм большинства микробов достаточно температуры в пределах 61,5-85°С и экспозиции соответственно от 30 до 3 мин. Споры бактерий погибают при температуре выше 100° С. Следует помнить, что при снижении влажности устойчивость бактерий и их спор  к высоким температурам повышается. Так, в условиях влажного жара споры гибнут при 110-120°С в течение  20-30 мин, а в условиях сухого жара  – при 180° С и экспозиции 45 мин.

Микроорганизмы существенно отличаются по чувствительности к действию температуры, что, по-видимому, можно объяснить различной организацией их клеток и, прежде всего, их оболочек. Так, необратимые процессы в клетках пневмококков начинаются при температуре 45-50° С, а в клетках стафилококков – при 60-70° С. В то же время ряд термофильных бактерий Methanobacterium  thermoautotrophicum, Thermoactinomyces vulgaris  и других вегетируют при температуре 60 – 700 С и даже при более высоких. Гибель микроорганизмов под действием высоких температур наступает вследствие денатурации клеточных белков. Помимо этого высокие температуры разрушают осмотический барьер клеток, нарушают равновесие ферментативных  реакций и пр.

Стерилизация под действием высоких температур может осуществляться различными способами: прокаливанием в пламени горелки, кипячением, пастеризацией, сухим жаром, влажным жаром, насыщенным паром под давлением (автоклавирование).

Фламбированием (прокаливанием в пламени горелки) стерилизуют бактериологические петли, бактериологические иглы, кончики пинцетов, пробочные  сверла и некоторые металлические  предметы. В микробиологической практике часто пользуются бактериологической петлей, которая служит для забора микробного материала. Изготавливается бактериологическая петля  из платиновой или нихромовой  проволоки  длиной 8-10 см, один конец которой загнут в виде круга, другой закрепляется в специальном металлическом держателе.

Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе на слабом огне, чтобы избежать разбрызгивания жидкости. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения воду сливают и инструменты берут стерильным пинцетом. Кипячением  стерилизуют шприцы (в разобранном виде), металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты), резиновые перчатки и пробки и пр. Инструменты, содержащие металлические части, стерилизуют  в 2%-м  растворе гидрокарбоната  натрия, который предупреждает появление ржавчины.

Пастеризация (неполная стерилизация) – это уничтожение в материале только  вегетативных клеток  микроорганизмов. С этой целью его подвергают воздействию температуры 75-80° С в течение 5-10 мин. Пастеризуют чаще всего продукты питания (молоко, соки, ягоды, фрукты, вина и т.д.), которые при воздействии высоких температур теряют свои вкусовые и пищевые качества. При пастеризации гибнут споры грибов, вегетативные клетки бактерий, в том числе и патогенных, тогда как бактериальные эндоспоры  остаются жизнеспособными. Их прорастанию при хранении продуктов препятствуют низкие значения рН, высокие концентрации  сахара, отсутствие кислорода и некоторые другие факторы.

Стерилизация сухим жаром осуществляется в сушильных шкафах. Наиболее часто в лабораториях используется электрический сушильный шкаф 2В-151. Он состоит из корпуса, в котором находится цилиндрическая рабочая камера. В камере расположены съемные рабочие полки. Шкаф обогревается при помощи нагревательной проволоки, намотанной на термостойкую пластинку, находящуюся на наружной поверхности камеры. Пространство между стенками корпуса и рабочей камеры заполнено термоизоляционным материалом. В шкаф  вмонтирован термометр. Обогрев регулируется при помощи автоматического терморегулятора.

Максимальная температура в сушильном шкафу достигает 200°С. Горячим воздухом в сушильном шкафу чаще всего стерилизуют стеклянную посуду (пробирки, воронки, пипетки, стаканы, конические колбы Эрленмейера, колбы Бунзена, шприцы и т.д.). Перед стерилизацией посуду моют, сушат и заворачивают в бумагу, при этом пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками.

Продолжительность стерилизации при температуре 1600 С  — 2 ч, при 1650 – 1ч, при 1800 – 40 мин, а при 2000 С – 10-15 мин. При стерилизации споры бактерий переносят высокую температуру в течение длительного времени.

Следует иметь в виду, что при температуре 1700 С бумага и вата желтеют, а при более высоких температурах – обугливаются. По окончании стерилизации сушильный шкаф выключают, но дверцы его не открывают до полного охлаждения, т.к. холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизация влажным паром (текучим паром) или дробная стерилизация (тиндализация) производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном и электронагревательным устройством. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняется на 2/3 водой.  В крышке аппарата вмонтирован термометр и имеется отверстие для выхода пара. В аппарате Коха стерилизуют главным образом питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 1000 С. Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации. При этом материал, чаще всего питательные среды, подвергается трех- или четырехкратной обработке влажным жаром в течение одного часа при температуре 56 – 750 С с интервалом 24 часа, в течение которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор.  Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании материала.

Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование) основана на прогревании какого-либо материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Известно, что температура насыщенного пара зависит от давления – с повышением давления его температура возрастает. В связи с тем, что с увеличением давления температура кипения жидкостей возрастает, появляется возможность стерилизовать их при 1000 С и выше, не допуская кипения и, следовательно, испарения и разбрызгивания. Продолжительность стерилизации паром под давлением зависит от химического состава стерилизуемого материала, видов микробов, находящихся в нем, а также от объёма (теплоёмкости) сосудов, в которых проводят стерилизацию. Условия повышенного давления насыщенного пара создают в специально герметически закрывающихся толстостенных аппаратах — автоклавах. Они бывают различной конструкции, но принципиальная схема  их одна и та же. Эти две камеры – большая (рабочая или стерилизационная) и маленькая (водопаровая), сообщающиеся между собой трубопроводом с вентилем. Водопаровая камера сообщается также с внешней средой трубкой с водомерным стеклом, краном и воронкой, через которую она заполняется дистиллированной водой. Рабочая камера, в которую помещают стерилизуемый материал, снабжена краном для выхода воздуха, манометром для определения давления пара и предохранительным клапаном для выхода пара при чрезмерном повышении давления.

ПРАВИЛА РАБОТЫ С АВТОКЛАВОМ

В рабочую камеру помещают материал для стерилизации, а в водопаровую камеру наливают воду с таким расчетом, чтобы уровень ее в водомерной трубке был между верхней (максимальной) и нижней (минимальной) чертой. Крышку автоклава привинчивают  к корпусу, завинчивая болты попарно во избежание перекоса крышки. Открывают краны и включают источник обогрева. Когда пар из выпускного крана начинает выходить непрерывной струей, кран закрывают и наблюдают за повышением давления по манометру.

Нагревание воды в водопаровой камере осуществляется с помощью вмонтированных в нее электродов и регулируется автоматически. Началом стерилизации считается тот момент, когда  стрелка манометра показывает заданное давление. Это давление поддерживают путем регулирования подогрева. Между показаниями манометра и температурой кипения воды существует следующая зависимость:

Показатели манометра, атм:     Температура кипения воды, 0 С:

0 (760 мм рт.ст.)                               100

0,2                                                     105

0,4                                                     110

0,5                                                     112

0,6                                                     114

0,8                                                     117

1,0                                                     121

1,5                                                     127

По окончании времени стерилизации подогрев прекращают. Необходимо дождаться, когда давление в автоклаве сравняется с атмосферным. Затем постепенно открывают кран, выводящий пар. Только после падения давления до нуля и выхода пара медленно отвинчивают болты крышки автоклава (снова крест-накрест), открывают крышку, ориентируя ее на себя для защиты от выходящего пара. Если во время стерилизации давление начинает подниматься выше заданного уровня, уменьшают нагрев или выпускают часть пара через предохранительный клапан. Для работы с автоклавом допускаются лица, прошедшие специальное обучение.

ПРОВЕРКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕПЛОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Поскольку при автоклавировании бактерицидное действие оказывают высокие температуры и насыщенный пар, а у большинства автоклавов (по соображениям простоты и безопасности) вмонтированы только манометры, каждый раз возникает необходимость убедиться в том, что материал подвергся воздействию стерилизующей температуры в течение достаточно длительного времени. Контроль температуры в автоклавах осуществятся при  помощи специальных термоиндикаторов – термочувствительных красок, изменяющих окраску после воздействия стерилизующей температуры, или веществ (сера, сахар), плавящихся только при определенных температурах.

Контроль эффективности бактерицидного действия высоких температур осуществляют, помещая вместе с материалом, подлежащим стерилизации, полоски бумаги, на которые нанесены споры устойчивых к нагреванию бактерий, например, Bacillus subtilis или ампулы, содержащие споры В. stearothermophilus, которые относятся к числу наиболее термоустойчивых. После окончания стерилизации полоски бумаги или ампулы помещают в условия, благоприятные для прорастания спор.

Стерилизация фильтрованием

Многие компоненты жидких питательных сред термолабильны и быстро разрушаются под воздействием высоких температур, поэтому жидкие питательные среды и другие жидкие материалы удобнее всего (значительно быстрее и эффективнее дробной стерилизации) стерилизовать фильтрованием. Впервые стерилизация жидкостей фильтрованием была проведена Шамберланом, учеником Пастера. Он изготовил фарфоровый фильтр, представляющий собой полый цилиндр, закрытый с одного конца и напоминающий свечу – свеча Шамберлана. Фильтр задерживает самые мелкие из всех известных бактерий. Для стерилизации питьевой воды используют фильтр Беркефельда – свеча Беркефельда. Стенки свеч Шамберлана и Беркефельда состоят из глинозема, фарфора или кизельгура. Эти материалы несут положительный электрический заряд, в то время как бактерии заряжены отрицательно. Таким образом, механизм фильтрации через свечи заключается не в «просеивающем» их действии, а носит адсорбирующий характер. К адсорбирующим относятся также фильтры, изготовленные из глины, асбеста и некоторых других материалов. Поры этих фильтров больше, чем размеры бактерий.

В настоящее время в микробиологической практике широко применяются асбестовые и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры представляют собой пластинки толщиной 3–5 мм и диаметром 35 и 140 мм. Для стерилизации используют отечественные фильтры марки «СФ» (стерилизующий фильтр). Перед употреблением асбестовые пластинки монтируют в специальный аппарат – прибор Зейтца, состоящий из двух частей: металлического или стеклянного полого цилиндра и нижней части с опорной сеткой. На опорную сетку кладут асбестовый фильтр и обе части аппарата соединяют винтами или зажимами. На трубку нижней части аппарата одевается резиновая пробка, посредством которой он вставляется в колбу Бунзена, приготовленный таким образом прибор Зейтца обертывают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. Стерилизуемую жидкость наливают в цилиндр и соединяют боковой отросток колбы Бунзена с вакуум-насосом. В результате образующейся разности давлений жидкость проходит через асбестовый фильтр в приемник (колбу). В аппарат Зейтца могут монтироваться также стерилизующие стеклянные и мембранные фильтры.

Мембранные фильтры изготавливают из ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы, представляющие собой тесное переплетение нитроцеллюлозных волокон. Метод их изготовления позволяет контролировать максимальный размер частиц, проходящих через фильтр. Поры фильтров имеют неправильную форму и занимают примерно 80% его площади. Диапазон максимальных размеров задерживаемых частиц в зависимости от номера фильтра может варьировать от 0,01 до 8,0 мкм.

Вследствие малого размера пор и высокого поверхностного натяжения, возникающего при соприкосновении с жидкостью, с нитроцеллюлозными фильтрами работают, используя давление или разрежение. Чтобы уменьшить гидрофобность фильтров, в них вводят детергент (поверхностно-активное вещество), а во избежание высушивания обрабатывают глицерином.

Непосредственно перед применением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Их помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60° С, и, чтобы предупредить скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 мин, меняя 2–3 раза воду. При этом с пластинки фильтра удаляется глицерин. Стерильные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным (стерильным) остуженным пинцетом с гладкими кончиками. Мембранные пластинки, как и асбестовые, монтируются в специальные фильтровальные аппараты, в том числе и аппарат Зейтца.

В настоящее время для стерилизации применяются также молекулярные фильтры, которые отделяют малые макромолекулы от больших и эффективно задерживают вирусные частицы. В качестве молекулярных фильтров используются мембраны «Диафло» или «Пелликон», выпускаемые американскими фирмами, а также отечественные ядерные фильтры (ядерные сита). Последние представляют собой тонкие лавсановые пленки с калиброванными тяжелыми ионами отверстиями, которые крепятся на более толстом поддерживающем слое с губчатой структурой. Диапазон молекулярных масс пропускаемых молекул варьирует от 500 до 100000 дальтон.

Стерилизация облучением

На клетки бактерий летальный эффект оказывают ультрафиолетовые, рентгеновские, гамма-, альфа-, бета-лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области, более 80% энергии которого приходится на длину волны 253,7 нм. Бактерицидные лампы, применение которых ограничено из-за малой проникающей способности, используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха помещений. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры. Ультрафиолетовые лучи вызывают острое воспаление роговицы глаз, поэтому  работают с кварцевыми лампами в защитных очках.

Химическая стерилизация (дезинфекция)

Дезинфекция представляет собой удаление или разрушение патогенных микроорганизмов, находящихся на неживых объектах, с помощью химических агентов – дезинфицирующих веществ. Она проводится, когда невозможно применить стерилизацию паром или другими физическими методами.

Бактерицидное действие химических агентов обусловлено активностью функциональных групп, концентрацией активного компонента вещества, длительностью контакта, рН, температурой, влажностью и присутствием органического вещества.

Галогены и их производные (хлор, йод и др.). Основой хлорных дезинфицирующих веществ является гипохлорит натрия, широко применяются хлорамины, получаемые путем замещения хлором водорода аминовых или иминовых групп. Используются спиртовый раствор (настойка) йода или его производное (йодофор-вескодин). Хлор и йод активны против всех бактерий и их спор, но они активно соединяются с белком, поэтому в его присутствии их следует брать в избытке.

Соединения тяжелых металов (ртути – хлорид ртути (II), оксицианид ртути, а также  серебра, меди) в большей степени оказывают бактериостатическое действие.

Фенольные соединения (о-фенилфенол) эффективны против вегетативных клеток в больших разведениях, но часто неэффективны против бактериальных спор.

Спирты (этиловый, изопропиловый) содержат гидроксильные группы, придающие им бактерицидные свойства. Дезинфицирующие свойства спиртов увеличиваются прямо пропорционально концентрации от 50 до 700. Спирты не вызывают гибели спор и обладают медленным обеззараживающим действием.

Микрооцидные газы (формальдегид, окись этилена, пропиолактон). Формальдегид обладает выраженной спороцидной активностью, но острым раздражающим запахом и способностью образовывать на поверхности стерилизуемого органического материала слой свернувшегося вещества, защищающий находящиеся внутри микроорганизмы. Максимальный стерилизующий эффект отмечается при относительной влажности 70% и температуре 220 С. При низких температурах формальдегид теряет активность. Окись этилена, используемая в виде газовой смеси, в которой на ее долю приходится от 2 до 50%, а вторым компонентом является азот или углекислота, эффективно убивает вегетативные клетки и споры бактерий. Окись этилена не оказывает вредного действия на органические материалы, легко повреждающиеся при нагревании, поэтому ее  применяют для стерилизации питательных сред, содержащих термолабильные компоненты. Окись этилена токсична, нестойкая и распадается в водных растворах, образуя этиленгликоль, а также взрывоопасна.

Поделитесь своим мнением
Для оформления сообщений Вы можете использовать следующие тэги:
<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

Рубрики
© 2017 Сайт рефератов my-ref.net  Войти